# SSAD-GAGs 单细胞 RNA-seq：项目概览

## 基本信息

- 矩阵：单细胞 RNA 测序（scRNA-seq, 10x Chromium）
- 物种：小鼠（Mus musculus，GRCm39）
- 样本数：6（Control 3 + Disease 3）
- 测序平台：NovaSeq X Plus，PE151
- 细胞注释：SingleR + celldex MouseRNAseqData / ImmGenData
- 分析阶段：19 个 R 脚本，线性流程

## 实验设计

组别 | 样本 ID | 描述
--- | --- | ---
Control | Control1, Control2, Control3 | 正常对照
Disease | SSAD_GAGs1, SSAD_GAGs2, SSAD_GAGs3 | SSAD-GAGs 疾病模型

分组顺序固定为 Control → Disease，所有图表和统计比较均遵循此因子顺序。

## 核心发现

### Macrophages 是 Disease 模型的核心响应群体，缺氧应答信号显著上调

1. Macrophages 差异最显著（4,514 DEG），其次 Fibroblasts（2,956）、Granulocytes（2,823），被自动选为重点亚群进行下游分析
2. 缺氧应答（Hypoxia response）通路在 Disease 富集亚群强烈激活：cellular response to hypoxia FDR < 1e-16，涉及 Egln3、Bnip3、Ndrg1、Pdk1 等 HIF-1α 通路下游基因
3. 重聚类后定位关键 Macrophage 亚群：Disease 富集亚群以 Pf4、Cav1 为标志（log2FC > 2）
4. 功能态打分显示 Disease 组在促炎、氧化应激模块得分升高，其余 4 个模块（抗炎/凋亡/ECM/IFN）也有组间差异

## 细胞类型组成

各细胞类型在两组中的细胞数
| Control | Disease | Total
--- | --- | --- | ---
Granulocytes | 11,911 | 10,656 | 22,567
Macrophages | 7,556 | 7,829 | 15,385
Fibroblasts | 4,150 | 2,447 | 6,597
Monocytes | 3,535 | 2,862 | 6,397
T cells | 1,247 | 666 | 1,913
Endothelial cells | 819 | 295 | 1,114
Dendritic cells | 629 | 203 | 832
NK cells | 407 | 98 | 505
Adipocytes | 216 | 146 | 362
B cells | 136 | 92 | 228

## 分析流程

    01.R  加载 6 样本 Cell Ranger 输出，合并 Seurat 对象
     │
    02.R  QC 过滤 → 标准化 → PCA → Harmony 批次校正 → UMAP → 聚类
     │
    03.R  SingleR 自动注释（MouseRNAseqData + ImmGenData）
     │
    04.R  细胞比例检验 + 全细胞类型 DE → 自动选择重点亚群
     │
     ├── 05-09.R  重点亚群差异表达 + 可视化
     │     ├── 05: Volcano + Heatmap
     │     ├── 06: GO 富集
     │     ├── 07: Top genes 热图
     │     ├── 08: KEGG 富集
     │     └── 09: 关键基因 Violin/DotPlot/FeaturePlot
     │
     ├── 10-11.R  Monocle3 轨迹推断 + 拟时序驱动基因
     │
     ├── 12.R  DEG 全表导出
     │
     └── 14.R  重点亚群重聚类（去污染）
           │
           ├── 15.R  GSEA（GO + KEGG）
           ├── 16.R  各亚群 GSEA
           ├── 17.R  Pseudobulk + 样本相关性
           └── 18.R  KEGG 通路图（pathview）

    19.R  功能态基因集定义 + Module Score 打分

## 分析摘要

阶段 | 结果
--- | ---
总样本数 | 6（3 Control + 3 Disease）
细胞注释 | SingleR 自动注释
差异分析 | Disease vs Control（Wilcoxon）
轨迹推断 | Monocle3 拟时序
富集分析 | GO / KEGG / GSEA
功能态模块 | 7 个模块打分（促炎/抗炎/氧化应激/凋亡/ECM/增殖/IFN）

推荐阅读顺序

按以下顺序阅读可获得最完整的分析脉络：

1. QC + 注释 — 质控过滤、PCA/UMAP 降维、SingleR 细胞类型注释
2. 差异分析 — Disease vs Control 差异基因 + 可视化
3. 轨迹推断 — Monocle3 拟时序分析
4. 富集分析 — GO / KEGG / GSEA 通路富集
5. 亚群分析 — 重聚类 + 亚群 GSEA
6. 功能态打分 — 7 个功能模块 Module Score + 组间比较

📂 本节相关产出文件

样本信息

- sample_info.csv — 样本分组信息 | 在线下载 | 本地查看
- 03_cell_type_stats.csv — 各细胞类型统计 | 在线下载 | 本地查看